體外受精與卵子

IVF and OOCYTE

郭宗正博士主講 陳瑞乾醫師校閱 徐慧萍醫師整理

【前言】

此次演講內容，是將第十一屆世界試管嬰兒學會中，多篇關於 OOCYTE的研究報告，與目前世界的研究重點及與會時各國著名學者討論的心得，匯集後作一整理，主要內容包括有：

  1. Recombinant FSH。
  2. GnRH antagonist。
  3. IVM of immature oocyte。
  4. Oocyte-follicle-ovary cryopresenvation。
  5. Polar body biopsy。
  6. Mitochondria and oocyte aging。

【一】生殖細胞的有絲分裂、減數分裂與極體的產生

無論是體細胞或原始生殖細胞，在複製之時都需實行 mitosis（有絲分裂）。在 cell cycle中，mitosis只佔了一小部份，而超過90%的時間為interphase。Interphase可再分為G1、S及G2三個Stage，G1是細胞成長、mitochondria成長與複製的時期，S是DNA複製期，在此時一個chromosome會複製成二個chromaid；而mitosis可再分為四期：prophase、metaphase、anaphase 及telophase，最終會將一個細胞分裂為二個。

Mitosis進行時，同源染色體（homologous chromosome）之間並無關聯性，在metaphase 時所有chromosome都會排列在赤道（equatorial plane）上，經由spindle把在interphase 時已複製好的二條chromatid分開各別拉到細胞二端去，在telophase時母細胞就會分成二個子細胞。因此子細胞染體數目在分裂後是恢復和母細胞一樣的雙套。

而 primordial germ cell （原始生殖細胞）在產生配子時，需要進行meiosis（減數分裂）。人類的primordial germ cell原是雙套（2n）共46個染色體，在interphase時每個染色體會複製成二條chromatid；在第一次減數分裂時來自於父母的同源染色體會兩兩相對排列在赤道板上，spindle向細胞二端拉時會把成對的同源染色體分開，各自到一個細胞去，這時子細胞所有的染色體是單套。23條；在第二次減數分裂時，同一個染色體的二條chromatid會如同mitosis般被分開。因此減數分裂最後產生四個配子，所帶有的染色體是23條單套，只有原來母細胞的一半。而配子（gamete）與配子的結合就是受精，最終產生的叫合子（zygote）。

在胚胎 6至8週時，即出現了primordial germ cell，若其帶的性染色體是XY，則會分化為spermatogonium（精原細胞）一直成長後會分化為primary spermatocyte（初級精母細胞），其所帶的染色體在人類是雙套46個；經過第一次減數分裂後會變成二個只有單套染色體的secondary spermatocyte；第二次減數分裂後形成四個spermatid，最後會成熟為spermatozoon。

在女性胚胎，最初出現的是 oogonium（卵原細胞，複數為oogonia）分化為primary oocyte（初級卵母細胞），經過第一次減數分裂形成二個細胞，但和精蟲不一樣的是，這二個細胞大小不同，大者為secondary oocyte，小者為first polar body，幾乎不含任何細胞質，而會被排斥到secondary oocyte之外， zona pellucida內面。雖然secondary oocyte尚未完成減數分裂，在人類是僅有單套23條染體，但已是成熟可取出體外授精使試管嬰兒的卵，故稱為mature oocyte。第二次減數分裂要在受精後精子進入卵後才會全部完成，分裂之後除了mature oocyte（即ovum）外，也會產生一個secondary polar body。因此看到secondary polar body時，即代表meiosis己完成。

理論上 first polar body也會完成第二次的減數分裂變成二個小細胞，在動物身上可見到meiosis最終有一個ovum及三個 polar body；但在人類罕見到first polar body進一步的分裂，因此大部份減數分裂完是停留在一個ovum、一個first及一個secondary polar body。

【二】 Recombinant FSH

DNA的重組技術製造了許多人工合成的hormone，如：insulin、growth hormone 及interferon等，是目前利用最廣的，而近來已將此技術發展到FSH、LH等。

目前在台灣上市 recombinant FSH的有二種，一種是濃度75 IU/A 的gonal-F，較常被使用；另一種是濃度較低（50 IU/A ）的Puregon。無論是哪一種，價格上都比urine FSH貴。

Recombinant FSH製造上較常用的是Chinese Hamster Ovary（CHO）cells，這個cell line最大的特色是容易吸入外來的基因（foreign genes）後表現之，產生新的產品，

人類的 gonadotropins如hFSH、hLH、HCG是屬於glycoproteins，都有一個 a chain及一個 b chain，其最大的特色是三種hormone 的 a chain都一樣，由89個amino acids組成，但三者的 b chain都不一樣，其中hFSH、hLH 的 b chain較類似，作用在同一個receptor上，因此在刺激排卵時可給予hCG來代替LH surge 。

Recombinant FSH的製造過程是把 a 及 b chain的DNA分別植入 E.coli（transmitter）的DNA上， transmitter 會自動進入CHO cell內，這過程叫transfection。 a 及 b chain genes在進入nucleus 後會與CHO cell的染色體結合，一起transcription製造出mRNA再 translation產生 protein ，即 a 及 b chain，最後再組合成FSH，這是最 pure的 FSH。

以下是幾篇較受肯定， cases數較多的關於recombirnant FSH的研究：

首先介紹的是比利時一位女醫師的研究。她把 108位病人分成二組，一組r-FSH 225 IU至少五天，另一組除了r-FSH外，第六天開始用r-LH 150 IU ；病人是使用Lupron 來做down regulation，而在月經第一天，也就是使用FSH之前先測血中的LH concentration，依此把病人分成二組，一組是LH £ 1.5 mIU/ml者，另一組LH > 1.5mIU/ml，表示Lupron的抑制效果不完全。結果發現在LH £ 1.5 mIU/ml這一組，無論使用r-FSH或再併用r-LH，二組的懷孕率差不多，約四成左右，而implantation rate二者間也無統計學上的差異；但在LH > 1.5miu/ml即Lupron抑制效果不好的這組病人中，光使用r-FSH的懷孕率可達50%，併用r-LH後卻僅有30%。因此對於LH level高者，如Lupron抑制效果不好，或polycystic ovary syndrome，光用r--FSH不併用r-LH的效果較好。

關於 Puregon的研究中，選取三個較好的來介紹。在study I中是以18至39 歲婦女為對象，比較給予不同濃度的r--FSH（100 IU v.s 500 IU）下之效果，發現使用100 IU r�FSH者取到的卵數目較少，懷孕率較低，但可能與cases數不多有關。在study II中以年紀較大，30至39 歲婦女為對象，給予不同濃度的r�FSH（150 IU v.s 250 IU），發現二組懷孕率並無差異。在study III是比較recombinant FSH 150 IU 與urine FSH 225 IU，得到的懷孕率及implantation rate二組差不多，但因r�FSH價格較高，雖然使用的劑量較低，實際5 r-FSH與u-FSH的經濟效益差不多。不過u-FSH的缺點是品質不穩定，而為r-FSH所無。

【三】 GnRH antagonist

在近十幾年來使用 GnRH agonist 的目的主要是防止premature LH surge，因若在卵子未成熟前就有LH surge時，會造成濾泡黃體化而不排卵；另外也可使oocyte成長速度平均，而能得到同一時期的卵。但缺點是需要使用二十幾天才會有效。目前常用的有subcutaneous給予的 Leupron， Suprecur，及噴鼻劑Supremon。

而 GnRH-antagonist也有 LH suppression的效果，其實已開發多年，但因其有histamine-releasing property，會造成全身或皮膚的anaphylactoid-like effect等complicaions，因此一直無法廣泛使用。在第三代GnRH-antagonist開發出來後，不僅較少histamine-releasing property anaphylactoid-like effect，且有較高的biologic potency使用期間較短，刺激需時較短，3-5天即可達到效果，有時只要一針高劑量即有效。目前GnRH antagonist的劑型有 subcutaneous結予的 Orgalutran（Ganirelix）及Cetrotide（Cetrorelix）。

研究方面，將 GnRH antagonist Orgalutran與噴鼻劑GnRH agonist Supremon做一比較。Supremon是在前一週期第二十天即黃體期開始給予，Orgalutran是FSH刺激第六天，即月經周期的第七天開始使用。結果發現，達到抑制所需的時間Supremon要26天，Orgalutran要5天，給病人的suffering 就有所不同；而在需要FSH刺激的時間長短上，Supremon較長；在代表抑制不成功的premature LH suge方面，Orglutran比例較高，且implantation rate及懷孕率也不如Supremon。這可能是因為使用GnRH antagonist（Orgalutran）造成的LH surge較多，及目前仍對此新藥的使用及劑量上不清楚導致於無法得到最好的效果。

【四】 In vitor maturation of immature oocyte

所謂 immature oocyte，指的是GV stage oocyte（germinal vesicle），此時期的oocyte仍保有 nuclear membrane，未被分解，處在第一次減數分裂的prophase，因此在顯微下若看到核膜，表示此oocyte，這些immature oocyte 需在試管內培養成mature oocyte即第二次減數分裂的metaphase之後，才具有受精能力，此過程即為in vitro maturation（IVM）。

最早開始研究 IVM的是1991年韓國Dr. cha，他自剖腹產的病人卵巢取卵，而1994年澳洲Dr.Trounson也有成功的案例，是自polystic ovary syndrome病人取下的卵巢取卵抽出，除此之外，取得immature oocyte 也可自oophorectomy病人取下的卵巢用針抽出。在培養方面，maturation medium可用 Ham's F-10 或fissur culture meclium（TCM）-199；但因這些OOCYTE是不成熟的，所以培養時需額外加入supplement如human folliculan fluid（HFF）、fetal bovine serum（FBS）、hCG、hMG、FSH等。

Dr.Cha在1991年為七位病人做過IVM，五位是premature ovarian failure，一位menopause，一位repeated IVF failure，而使用的卵來自於C/S時的卵巢。結果有三位不幸流產，但其它四位都成功生育。在此之後，許多學者致力於IVM的研究，最近開發出來的是使用cold culture的技術。

在做 IVM時，若觀察到GV cell 的germinal vesicle breakdown （GVBD），即核膜消失時，表示”maturation initiation”；而出現first polar body，即完成第一次減數分裂時，稱為”maturation completion”，此時oocyte已成熟，具有受精的能力。在實驗中觀察到，達到80%的maturation initiation所需時間，在有用FSH或hMG刺激的immature oocyte需十幾個小時，未用藥物刺激的immature oocyte需要約二十一小時；而在maturation completion所需時間，有刺激者要三十小時，未刺激者需四十小時左右。由此可知，immature oocyte 做IVM時，至少要培養一天半後才可得到成熟的卵來受精。

【五】 Oocyte-Follicle-Ovary Cryopreservation

卵巢內 follicle成熟分四個階段：

  1. primordial follicle：其為一個oogonium與外圍一層pregranulosa cells 所組成。
  2. primary follicle：濾泡及卵皆開始分化成熟，在primary oocyte之外可見到一圈zona pellucicla。
  3. secondary follicle：在granulosa cell中可見到一個積蓄一些液體的antrum。
  4. mature follicle：在此時卵已完成第一次減數分裂，故可見到secondary oocyte 及first polar bday。

目前 cropreservation技術的進步，已可成功的冷凍胚胎及精子，唯獨對於卵的冷凍有技術上的困難。接下來介紹不同階段的卵在冷凍保存的技術及困難點。

  1. cryopreservation of mature oocyte（metaphase II）最大的問題是：解凍後的存活率很差，使用PROH（一種cryoprotectant）可得到的post-thaw survival rate約僅有60%，因此fertilization rate也很低。原因可能是冷凍後zona pellucida會變硬，或是冷凍後染色體間發生不分離（non-disjunction）而產生aneuploidy，也可能是因冷凍破壞了cytoskeleton。目前可以克服zona pellucida hardening，卻仍無法處理aneuploidy的問題。第一個成功冷凍mature oocyte是1986年Dr.Cha在未有 intracytoplasmic sperm injection（ICSI）的技術下完成的；在1997年有ICSI技術後成功率上升，但仍偏低。
  2. cryopreservaion of immature oocyte（GV stage oocyte）因為mature oocyte 在冷凍上有許多無法克服的問題，陸續有學者開始研究關於immature oocyte的冷凍方式。Immature oocyte指的是處在diplotene stage（prophase I）的GV stage oocyte，不具有spindle，因此不會因spindle在冷凍過程中變性而在meiosis時無法將chromosome拉開造成aneuploidy的問題，但解凍後就需要IVM。目前IVM技術尚未成熟，成功率不高，不過1998年在美國已有一例用immature oocyte冷凍保存後做IVM的成功案例。
  3. Cryopreservation of primmordial follicle選擇primordial follicle主要是因在oocyte周圍有一層pregranulosa cells ，可能在冷凍時可以提供給oocyte一些保護。其他的優點有：
  1. primordial follicle 沒有zona pellucida，因此也沒zona pellucida hardening的問題。
  2. 在此時期的 oocyte分化較不完全，因此若冷凍造成異常，仍有能力將其修正。
  3. 產生 cytogenetic errors，如aneuploidy、non-disjunction等的機率較低。

在卵巢中用 aspiration只會抽出oocyte，要使用collagenase（proteolytic enzyme）才能取到完整的primordial follicle。1993 年在mouse上已有成功的例子。

  1. Cryopreservation of ovarian tissue如對於leukemia女病人，是無法耗時在等待sitimulation cycle而延誤治療cancer的時機，因此為她們保留卵子或ovarian tissue是emergency cryopreservation可用 laparoscopy 把ovarian tissur取出。未來要把ovarian tissue重新放回體內時，可選擇放在ovarian bursa（即原來ovarian tissur所在處）skin下 或kidney capsule上。移植回原先取出之處稱為orthotopic transplant，而移植到別處稱為heterotopic transplant，又可分為人與人間的autograft及不同種動物間的xenograft。關於ovarian tissue的冷凍保存的第一個成功動物實驗是1994年用sheep做出的。
  2. Cryopreservation of whole ovary也有科學家嘗試把整個ovary取出，沖掉其中的血後，經ovarian artery 注入DMSO（一種cryoprotectors）後冷凍，解凍時把DMSO洗去，利用microsurgeny把血管接回體內使ovary重新得血液供應。目前在pig上已有成功的例子，且解凍後可保留80~90%的primordial follicles。

【六】 Polan body biopsy

首先要提到的是 preimplantation genetic diagnosis（PGD）著床前的遺傳診斷，包含二種，一種是受精前的（preconception），可做first of secondary polan body biopsy；另一種是受精後但床前（preimplantation），為6-10 cell 時期的embryo中取出一顆blastocyte 來診斷。

人類及其他哺乳動物的 secondary oocyte會一直停留在第二次減數分裂的metaphase一直到精子進入卵中，才會完成第二次減數分裂。精子進入卵後，尾巴會斷掉，在受精後約16小時可見到受精卵中有二個pronucleus（male and femal）二者結合後即是另一個新生命的開始。

高齡產婦的卵長時期停留在 metaphase II，可能染色體會發生non-disjunction後造成aneuploidy，或是有其他突變，故取出做IVF時無法得到好的懷孕率；因此有學者發展出polan body biopsy，希望可在受精前刪掉有缺陷的卵，找出正常的卵來做IVF。

關於 polar body biopsy的研究，1994年美國的Dr.Verlinsky使用chromosome-specific probes，其上帶有螢光染色，針對最易有trisomy的 chromosome 13.18.21及性染色體X.Y做fluorescent in situ hybridization（FISH）少。其原理是根據polar body與 oocyte間的關聯性，polar body的染色體數一條，則oocyte會多一條，反之亦然；故若polar body的染色體數目正常，則oocyte也會正常。因此我們可找出好的卵來受精，得到aneuploidy-free embryos，提高IVF懷孕率。

除此之外，可利用 polymerase chain reaction（PCR）來找出在polar body的染色體是否有 single gene defect ，如：thalassemia、cystic fibrosis、hemophilia、muscular dystropy 等，有的話代表相對應的卵也可能有此缺陷。

Dr. Verlinsky在近幾年來取了大於35歲婦女約4000顆卵來做biopsy；因polar body在固定上比oocyte困難，因此其中只有大約八成可做分析。結果發現abnormal oocyte佔了約40%，實在驚人！

【七】 Mitochondria and oocyte aging

Mitochondria是在 cytoplasma中的小器官，為內、外膜組成，在內膜上有electron transport system。Mitochondria可利用 oxidative phosphorylation pathway產生ATP供細胞使用，如一個分子的glucose代謝後可產生38個ATP，其中36個是在mitochondria產生的。因此若mitochondria發生病變，則細胞能量不夠，幾乎無法分裂，或是出現aneuploidy的突變。

Mitochondria 是maternal inherited，有自己的DNA（mt DNA），也在mitosis 的G1 stage複製，但具有self-replicating ability，其複製與分裂都和細胞的DNA無關。人類的mitochondrial genome 為16.6 kb環狀的DNA，其上並未帶有histone，所以較為脆弱而易mutation defetion，機率是nuclear DNA的15至20倍；最常見的是一段含ATPase gene的5 kb defetion，這種突變的mitochondria無法製造能源。

在氧化代謝過程中，多少會產生些 oxygen free radical造成cell damage, mitochondria對此尤其敏感。而female fetus仍在母親體內體內時就已形成primary oocyte，一直停留在prophase I ，二、三十年後隨著濾泡成熟才會繼續進行減數分裂。在這長時間的暫停下，mitochondria 一直累積mutation及 defetion，突變的程度隨著年齡而惡化，mitochondria的功能隨之下降，最後無法製造出足夠的能量供oocyte 完成減數分裂，或是造成aneuploiday，降低懷孕率。

因此有些學者致力於研究如何把年輕 donor oocyte 內的mitochondria 移植到年老的，mitochondrial aysfunction的 oocyte可以提供給 oocytes及 embryos 足夠的metablic activity。1997年美國的Dr. Cohen發表第一例成功的cytoplasmic transfer，但因其使用的是全部的細胞質，除了mitochondria外，可能還有殘存的donor DNA、Mrna在，有外來基因物質侵入之疑慮；因此若可以取pure mitochondria來移植會更佳，這項技術可能在不久的將來發展出。

 

體外受精與精蟲

吳孟興主講　陳瑞乾校閱　謝宜蓉整理

國立成功大學醫學院附設醫院　婦產部

　　男性製造精蟲的 Y 染色體在不斷地演化過程中，由低等動物的基因中演化轉移至 Y 染色體，但是 Y 染色體並非是一個安全的環境來維持正常製造精子的過程無誤，因為在生殖細胞減數分裂時，需藉助大量染色體基因重組的過程來產生多變異性以適應環境的變化。 X 與 Y 染色體在減數分裂時無法配對而缺乏基因重組的機會，所以產生染色體缺失或突變的機會增加且無法修復，如此不斷遺傳下去，則 Y 染色體因為基因缺損，產生精蟲的製造能力便不斷下降，而帶來滅種的危機。因此將人類精子目前的研究分為四部分來探討：一、環境物質對精蟲的影響。二、性功能障礙及不同取精方法。三、基因染色體對精蟲的影響。四、精蟲染色質構造的概念。

環境物質對精蟲的影響

　　正常婦女懷孕率與精蟲數目 (4 千萬 /c.c) 以內是成等比級數的關係，所以每 c.c 精液所含精子數目愈多，懷孕機會愈高。但一旦每 c.c 精液所含精子數目超過 4 千萬時，懷孕機率便維持一個常數。

　　針對男性生殖能力減退，目前有三個可能病因： 1. 生殖能力變差是屬於區域性的變化。 2. 睪丸癌發生機率增加。 3. 尿道下裂與隱睪症發生率也增加。而精子生成主要受下列四因素影響： 1. 生理因素：如年齡、禁慾、工作壓力。 2. 環境因素：如某些物質造成內分泌的破壞、輻射、熱能、金屬、抽煙等。 3. 基因因素。 4. 精神社會因素。

　　另一方面，對於男性生殖系統發育的異常，目前有 2 個假說： 1. 媽媽懷孕期間有受到女性荷爾蒙增加的刺激造成胎兒的影響。 2. 較重要的是，在環境或飲食方面接觸到類似女性荷爾蒙之化合物作用。所以女性荷爾蒙似乎有其角色存在，女性荷爾蒙的來源可分為四種： 1. 身體產生的：包含所吃的食物和身體脂肪的代謝。 2. 合成的：如避孕藥。 3. 來自植物或飲食攝取。 4. 環境代謝物：其實這類的產物是在 1930 ∼ 1950 年代開始產生的，但由於身體無法代謝此類化合物，目前正好是後遺症發生最多的時期。

　　環境中的物質其毒性作用方式可分成： 1. 直接方式：由於構造和體內荷爾蒙相似或本身即是化學活性很強的活化物。 2. 間接方式：藉由代謝物來產生毒性。環境中有許多物質如 DBCP 、重金屬、 DES 等皆會造成許多影響，主要是精子數目的減少。目前最熱門的焦點便是「戴奧辛」。戴奧辛不論是由空氣或水份吸收得到，其在身體內是很難代謝的，其中代表物是毒性最強的四氯雙苯 TCDD(2,3,7-8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin) 其來源包括： 1. 製造氯化性碳氫化合物工廠、漂白工廠、鋼鐵工廠以及汽機車工廠的工業廢物。 2. 焚化爐內廢棄物的燃燒。

　　若是在母親體內或經由母親哺乳接觸到這類化合物，由老鼠動物實驗中發現，會造成男性以下情況： 1. 陰莖和肛門距離縮短。 2. 睪丸下降延遲。 3. 生殖器官重量大小減少。由於在體內無法代謝掉，甚至影響到長大後造成精子生成能力降低、性行為女性化及 LH 分泌如女性化般地調節。

性功能障礙及不同取精方式

　　取精方式可分為非侵襲性與侵襲性。在不孕症的男性，其實有些是因為射精或勃起功能有障礙，我們可用非侵襲性的方法來幫忙取精。

射精障礙 (anejaculation)

　　射精障礙可分為三類： 1. 情境性 (situational) ：某些情境下有射精障礙。又可細分成： (1) 性交射精障礙：只能藉手淫射精。 (2) 手淫射精障礙：只能藉性交才能射精。 (3) 診所處射精障礙。 (4) 太太排卵期間射精障礙。 (5) 無法預期性射精障礙：以前沒有射精障礙，在要求取精下，第一次偶發性射精障礙。

2. 無高潮性的射精障礙：此類較屬於精神方面的問題或不明原因。此類病人有正常的夢遺現象，但醒著時便無法射精。我們可藉由振動器或電刺激方式來幫忙取精。 (1) 振動器：將陰莖置於振動器上，用比性交較強較持續的刺激來幫助射精。 (2) 電刺激：傳統上，我們將探頭放入肛門直腸處，直接對儲精囊、攝護腺和輸精管上的交感神經做刺激，誘發射精。兩者相較之下，電刺激必須作用在感覺神經正常的病人身上才有效，而振動器的使用較自然，可以有類似正常性交產生性高潮而有射精動作，且精子活動力也較好，較屬於物理性療法。

3. 有高潮性的射精障礙：此類較屬於有器官上的病變。完整的射精過程包含三個動作： (1)Emission ：藉由胸腰椎 (T12 ∼ L2) 處交感神經的支配使儲精囊和輸精管收縮，使一部分精液先運送至攝護腺處儲存。這動作發生問題可能原因有： (a) 構造上的阻塞：例如纖維化，使精液無法運送至攝護腺儲存。 (b) 神經因素：如有脊椎受傷導致交感神經受損傷。 (c) 內分泌不足：雄性激素會影響射精動作。 (2)Closure of the bladder neck( 膀胱頸的肌肉要緊閉 ) ：才不會導致精液逆流射至膀胱，這個動作是和 Emission 一起發生，皆由交感神經控制。若此動作有問題。可給予： (a) 交感神經或抗副交感神經的藥物來輔助。 (b) 若藥物無效，因為精蟲在鹼性環境中活動力較高，所以我們用藥先將尿液鹼化，使膀胱排空後再射精，精液逆流入鹼性的膀胱中，再排出收集。 (3)Antegrade expulsion ( 強力前進噴出動作 ) ：藉由體節神經支配尿道海綿體肌肉使其規律收縮，並使尿道外括約肌放鬆。使精液射出、此動作發生問題常見原因是遠端的阻塞。

勃起障礙 (erectile dysfunction)

　　要先瞭解夫妻雙方是否真的有勃起障礙的問題，有些病人是因為不孕症治療所造成的勃起障礙，我們可用威而鋼 (Viagra) 提供快速而有效的治療。若是因為無精蟲症 (azoospermia) 而導致的不孕症，無論是阻塞或非阻塞性，我們便要採取侵襲性的方式來取精，包括： (1) 睪丸取精 (TESE) ：直接由睪丸切片取得。 (2) 副睪取精 (MESE or PESA) ： PESA 是經皮盲目地穿刺取精， MESA 是經由顯微手術操作取精所以較準確和有效。取精完再配合 ICSI 顯微精蟲注射技術受精，兩者受孕率相似。

基因染色體對精蟲的影響

1. 染色體數量問題 ( 約佔 2 ∼ 14%) ，可分三種情形： (1) 所有染色體皆異常的約佔不孕症男性 2% ，佔精蟲數目少的男性中 5% ，佔沒有精蟲男性中的 10% ，包括性染色體異常 ( 如 47,XXY) ，或由 Robersonian translocation ， reciprocal translocation or chromosome inversion 所造成。 (2) 只有睪丸內的染色體有異常，約占不孕症男性 1 ∼ 17% 。 (3) 染色體皆正常，但精子在減數分裂時無法做有效分離的動作 (non-disjunction) 。

2. 單基因缺陷問題：影響精子生成主要是在 Y 染色體，但其它染色體異常也會影響精子造成男性不孕。 (1)X 染色體：男性只有一個 X 染色體，所以一旦有問題皆會表現出來。如 AIS(androgen insufficiency syndrome) 即是在 X 染色體上的 androgen receptor gene 發生突變，造成雖然是正常 46,XY 的男性卻有女性化的表現。 (2) 體染色體：要同對染色體上二個基因皆發生變異才會表現出。 CBAVD(congenital bilateral abscence of vas deferens) －先天性雙側輸精管缺失，便是在第七對染色體上的 CFTR(cystic fibrosis transmembrame conductance regulator) 發生變異所產生。 (3)Y 染色體： Y 染色體上有許多基因會影響精子製造，大部分都局限在 Yq11 的位置，此位置處至少有一個 Y 因子會影響生殖細胞的發育，如果把此段刪除掉，即會導致無精蟲症，所以我們稱此 Y 因子為 AZF(azoospermia Factor) 。經由不斷的研究陸續找出另有三個位置 AZF region(AZFa 、 AZFb 、 AZFcR) ，同樣在 Yq11 處，但不同於之前所提的。 AZF region 及 AZF 候選基因、這些基因缺乏皆會影響精子造成不孕。 AZF candidate gene(AZF 候選基因 ) 這些基因若有缺失，會表現出和 AZF 區段缺失相同的病症，代表者有二： (a)YRRM 即 RBM （ RNA Binding Motif ） gene 。 (b)DAZ （ Deleted in azoospermia ） gene 。這二者皆是以多重數量的方式存在。舉例而言， DAZ gene 在其它動物身上是存在於較安定的體染色體上，所以只需要 one copy ，但在哺乳類，此 DAZ gene 轉換到較不安定的 Y 染色體上，所以會自行複製增加數量來確保其存在，此種 multiple copy 情形下，只有 one copy 發生變異是不易表現出其異常的。

精蟲染色質 (chromatin) 構造概念

　　精子由精原母細胞不斷發育成精細胞，此過程中精子細胞愈來愈小，為了將細胞核所含的染色質皆濃縮包含入精細胞內，其需要不同於一般體染色體的染色質。一般體染色體是 histone-complexed DNA ，含雙股 DNA 及 protein histone ，但精子所含的是 protamine-complexed DNA ，含雙股 DNA 及 protein-protamine 。原因是 protamine ： 1. 分子小，可存於精子的頭裏面。 2. 可提供細胞核較結實的構造。 3. 可保護男性生殖細胞的遺傳物質。其實 protamine 是 histone 經由 post-translational modulation 而來的，先變成暫時的蛋白質 (TP1 and TP2) ，再慢慢變成 protamine(P1 、 P2) ， protamine 本身具有多樣性的構造，但其構造和功能沒有相關性。染色質不管在精子或卵子產生時，要先濃縮才能進行減數分裂，若此過程有問題，便會使精子無法成功地使卵子受孕或是受孕後易早期流產。在染色體基因檢查中，目前染色體數目異常或單一基因變異皆有較明確的檢查方法，但染色質的問題便較難檢查，染色質的不正常可能是遺傳造成分化不好或環境所造成，目前使用的檢查方法有下列三種： (1)FISH(fluorescence in situ hyboridization) 目前研究精蟲染色體數目異常最好的方法。 ( 同時可看出人類的精細胞是否有 diploid 的情形 ) 。 (2)CMA3 staining(chromomycin A3)Y 染色體上的染色質若是分化很好，即都是 protamine-complexed DNA ，則使用 DNA 染劑 Aniline blue 或 CMA3 ，精子的頭不會被染色出。若是精子 chromation 中 protamine 的成分有缺陷，便代表精子頭部濃縮的步驟有問題，核便會被染色。 (3)SCSA(sperm chromatin structure assay) 染色質的組成除了 protamine 或 histone 之外，尚有 DNA SCSA 便是要檢查其 DNA 是否是雙股構造，有無 denaturation 變單股 DNA 的情形。方法如下，先將染色質在 PH:1.2 環境下給予 30 秒壓力 ( 其狀態有如精子在 100 度下熱五分鐘一般 ) ，加上 acridine orange 一種 DNA 染劑後，再加上螢光並用 488nm 的雷射激光動作，若是雙股 DNA ，則呈現綠色，反之若是單股 DNA ，則呈現紅色。若精液分析中有超過 30% 的精子呈現紅色，則懷孕機率會減少很多。

結　論

　　造成男性滅種的危機 (the disappearing male) 有下列三項： 1. 男性精蟲產生的決定因子在 Y 染色體上，但 Y 染色體並非一個安全的環境來維持正常精子的製造。一般體染色體不管在環境影響下或生殖過程中發生任何變異，其皆可藉著基因重組的過程來修補，但男性精子中 X 與 Y 染色體在減數分裂時無法配對因而缺乏基因重組的機會，所以產生染色體基因缺失或突變的機會增加加上又無法修補 Y 染色體，基因漸漸缺損，製造精蟲的能力也不斷下降，而帶來滅種的危機。

2. 精蟲是具競爭性的，所以在動物的世界中，雄性若本身有問題的精蟲便會被淘汰掉。

3. 目前生殖技術的發達，已經可以試管嬰兒體外受精加上單一精蟲顯微注射，解決大多數男性不孕症的問題，但勢必將不良的基因繼續遺傳至下一代。然而由於基因工程與分子生物學的進步，以基因治療的方法，改進 Y 染色體上基因的問題，可使男性不孕症以不同的方法加以解決。